Σήμερα, ας μιλήσουμε για το πρόβλημα που έχει προκαλέσει αμέτρητους ερευνητικούς συναδέλφους πονοκεφάλους - πείραμα Western Blot (WB). Αυτό το φαινομενικά απλό, αλλά γεμάτο από πείραμα "παγίδων", γιατί μας κάνει πάντα να σκοντάφτουμε ξανά και ξανά; Τώρα ας αναθεωρήσουμε τους λόγους για τις αποτυχίες μαζί.
I. Χωρίς ζώνες
Πιθανοί λόγοι μπορεί να περιλαμβάνουν:
- Ζητήματα αντισωμάτων: Το αντίσωμα μπορεί να είναι αναποτελεσματικό, μη ειδικό ή μη δεσμευτικό για την πρωτεΐνη -στόχο.
- Θέματα δείγματος: Το δείγμα μπορεί να περιέχει παρεμβαλλόμενες ουσίες, να είναι πολύ χαμηλό σε συγκέντρωση ή να έχει ήδη υποβαθμιστεί.
- Θέματα ηλεκτροφόρησης: ακατάλληλες συνθήκες ηλεκτροφόρησης, όπως τάση, χρόνος ή ακατάλληλη χρήση του buffer.
- Θέματα μεταφοράς: Προβλήματα κατά τη διάρκεια της διαδικασίας μεταφοράς, όπως η ακατάλληλη επιλογή μεμβράνης, ο χρόνος μεταφοράς ή το ρυθμιστικό μεταφοράς.
- Ζητήματα αποκλεισμού: Η λύση αποκλεισμού μπορεί να είναι ακατάλληλη ή ο χρόνος αποκλεισμού μπορεί να είναι πολύ μακρύς.
- Ζητήματα χρώσης: Το αντιδραστήριο χρώσης μπορεί να λήξει, να μην είναι ευαίσθητο ή να χρησιμοποιηθεί ακατάλληλα.
Θέματα εξοπλισμού: Ο εξοπλισμός μπορεί να δυσλειτουργεί ή να μην βαθμονομηθεί σωστά.
- Πειραματικά ζητήματα λειτουργίας: Η πειραματική λειτουργία μπορεί να μην είναι τυποποιημένη, όπως ανεπαρκές πλύσιμο ή ανομοιόμορφη φόρτιση δειγμάτων.
- Θέματα τροποποίησης πρωτεϊνών: Η πρωτεΐνη στόχου μπορεί να υποβληθεί σε μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που εμποδίζουν την αναγνώριση αντισωμάτων.
- Ζητήματα έκφρασης πρωτεΐνης στόχου: Η πρωτεΐνη -στόχος μπορεί να έχει πολύ χαμηλή έκφραση ή μη έκφραση στα κύτταρα ή τους ιστούς που ανιχνεύονται.
Ii. Υψηλό φόντο
Πιθανοί λόγοι μπορεί να περιλαμβάνουν:
- Υψηλή συγκέντρωση αντισωμάτων: Η χρήση υπερβολικού αντισώματος μπορεί να αυξήσει τη μη ειδική δέσμευση, με αποτέλεσμα το υψηλό υπόβαθρο.
- Ζητήματα ποιότητας αντισωμάτων: Το αντίσωμα μπορεί να έχει υψηλή μη ειδική δέσμευση ή διασταυρούμενη αντίδραση με άλλες πρωτεΐνες.
- Ανεπαρκής αποκλεισμός: Το διάλυμα αποκλεισμού αποτυγχάνει να καλύψει αποτελεσματικά τις μη ειδικές θέσεις δέσμευσης στη μεμβράνη, με αποτέλεσμα το υψηλό υπόβαθρο.
- Ζητήματα μεμβράνης: Η μεμβράνη μπορεί να έχει κακή ποιότητα ή μόλυνση, οδηγώντας σε υψηλό υπόβαθρο.
- Ατελής μεταφορά: Κατά τη διάρκεια της διαδικασίας μεταφοράς, οι πρωτεΐνες μπορεί να μην μεταφερθούν πλήρως στη μεμβράνη, με αποτέλεσμα το υψηλό υπόβαθρο.
- Ανεπαρκής πλύση: Τα βήματα πλύσης αποτυγχάνουν να αφαιρέσουν αποτελεσματικά το μη δεσμευμένο αντίσωμα ή άλλες ακαθαρσίες, οδηγώντας σε υψηλό υπόβαθρο.
- Ζητήματα αντιδραστηρίου χρώσης: Το αντιδραστήριο χρώσης μπορεί να είναι πολύ ευαίσθητο ή ασταθές, με αποτέλεσμα υψηλό υπόβαθρο.
- Πειραματικά ζητήματα εξοπλισμού: Ο εξοπλισμός μπορεί να έχει διαρροές ή παρεμβολές, οδηγώντας σε υψηλό υπόβαθρο.
- Θέματα δείγματος πρωτεϊνών: Το δείγμα μπορεί να περιέχει μεγάλη ποσότητα παρεμβαλλόμενων ουσιών, όπως προϊόντα αποικοδόμησης πρωτεϊνών ή άλλες ακαθαρσίες.
- Πειραματικά θέματα λειτουργίας: Η πειραματική λειτουργία δεν μπορεί να τυποποιηθεί, όπως ο παρατεταμένος χρόνος επώασης ή η υψηλή θερμοκρασία.
Iii. Μη ειδικές ζώνες ή λανθασμένα μεγέθη πρωτεϊνών ζώνης
Πιθανοί λόγοι μπορεί να περιλαμβάνουν:
- Πάρα πολλά περάσματα των κυττάρων, με αποτέλεσμα διαφορετικά επίπεδα έκφρασης πρωτεϊνών, που οδηγούν σε ασυνεπή μεγέθη ζώνης ή στην παρουσία πολλαπλών ζωνών.
- Η αποικοδόμηση δείγματος πρωτεΐνης, με αποτέλεσμα το χαμηλότερο μοριακό βάρος πρωτεΐνης ή την παρουσία πολλαπλών ζωνών.
- Τα in vivo εκφρασμένα δείγματα πρωτεΐνης μπορεί να έχουν διάφορες μορφές τροποποιήσεων όπως η ακετυλίωση, η μεθυλίωση, η αλκυλίωση, η φωσφορυλίωση και η γλυκοζυλίωση, οδηγώντας σε ασυνεπή μεγέθη ζώνης ή στην παρουσία πολλαπλών ζωνών.
- Η πρωτεΐνη στόχου περιέχει πολλαπλές ισομορφές ή παραλλαγές ματίσματος, με αποτέλεσμα τα ασυνεπή μεγέθη ζώνης ή την παρουσία πολλαπλών ζωνών.
